BioScience Blog – Научный Биологический блог

Вестественной среде обитания доступные бактериям источники азота различаются по количеству и химическому составу. Для их эффективной ассимиляции микроорганизмы выработали различные системы регуляции, которые отвечают на изменение доступности азотсодержащих соединений и контролируют экспрессию определенных групп генов. Результатом этого является синтез различных вне – и внутриклеточных ферментов и белков, а также изменение азотного метаболизма внутри самой клетки. Ключевыми белками-регуляторами азотного метаболизма в клетках бацилл являются фактор транскрипции TnrA и его структурный гомолог GlnR – репрессор глутаминсинтетазы (ГС). TnrA активен в условиях лимитации азотом, GlnR является его антагонистом и функционирует при росте с избытком легкодоступного источника восстановленного азота. Активность фактора TnrA регулируется не фосфорилированием, а образованием белкового комплекса с ГС. В активном состоянии ТпгА находится в комплексе с мембраносвязанным белком NrgB. Белки NrgB и NrgA в клетках B.subtilisформируют аппарат транспорта аммония в клетки. При этом белок NrgA является транспортным, а NrgB – сенсорным. Было обнаружено, что возможен другой способ регуляции активности фактора транскрипции TnrA – путем его внутриклеточного протеолиза. При переносе отмытых клеток из бедной азотом среды (фактор TnrA активен) в среду без источника азота этот белок исчезает в течении 15 минут. В то же время этого не наблюдается в клетках дефектных по генам nrgAи nrgB, что свидетельствует об участии этих белков в передаче сигнала о наличии азота, доступного клетке. Мы провели протеолиз invitroочищенного белка TnrA грубым экстрактом клеток B.subtilis, а также его мембранной и цитоплазматической фракциями. Эксперименты показали, что протеолитическая активность, гидролизующая белок TnrA, локализована в цитоплазме. По-видимому, данная протеаза относится к вегетативным белкам клетки: TnrA подвержен протеолизу экстрактом, полученным из клеток до и после их переноса в среду без источника азота. Обнаруженная протеаза высоко специфична по отношению к регуляторным белкам: внутриклеточные ферменты, участвующие в синтезе аминокислот (ГС и NAG-киназа), не подвержены протеолизу клеточным экстрактом в условиях invitro, в отличие от регуляторного белка NrgB и фактора TnrA. Исследовали влияние различных ингибиторов на протеолитическую активность клеточного экстракта. Показано, что при инкубации в течение 20 мин клеточного экстракта с ингибитором сериновых протеаз PMSF (5мМ) активность подавляется полностью, с ингибитором трипсиноподобных сериновых протеаз бензамидином (5мМ) – на 60-80%. ЭДТА (10mM) не оказывает влияния на протеолитическую активность. Эти результаты позволили сделать заключение, что обнаруженная нами протеаза относится к классу сериновых протеаз. Был установлен рН-оптимум по гидролизу очищенного белка TnrA. Максимум активности наблюдается при рН 7.0, при значениях рН 8.0 и выше остаточная активность составляет 5-10%. Наши дальнейшие исследования будут направлены на очистку и идентификацию протеазы, осуществляющей протеолиз фактора транскрипции TnrA.