BioScience Blog – Научный Биологический блог

Котляров Р.Ю., Марданова Е.С.

Производство в растениях различных белков для медицины, сельского хозяйства и промышленности является одним из перспективных направлений биоинженерии. Одним из наиболее эффективных методов, позволяющих быстро получать в растениях значительные количества целевого белка, является использование самореплицирующихся рекомбинантных вирусных векторов. Обычно для их создания используют вирус табачной мозаики или Х-вирус картофеля, геномы которых имеют небольшие размеры и содержит + цепь РНК. Одним из ограничителей эффективности вирусных систем транзиентной экспрессии является «умеренность» исходного вируса, -большинство вирусных инфекций не летальны для растения и протекают в латентной форме, что сопровождается относительно низким уровнем синтеза вирусных белков. Один из новых высокопатогенных штаммов Х-вируса картофеля «Ока-2», выделенный специалистами Кафедры вирусологии Биологического факультета МГУ, эффективно репродуцируется в растениях, и может являться основой нового высокоэффективного вектора для экспрессии целевых белков. Целью данной работы было определение полной нуклеотидной последовательности этого вируса и получение полной ДНК-копии его генома для последующего создания на его основе экспрессионного вектора.

Для секвенирования вируса отдельные перекрывающиеся фрагменты вирусного генома были амплифицированы с помощью ОТ-ПЦР с использованием праймеров, последовательности которых соответствовали консервативным участкам геномов различных штаммов Х-вируса картофеля (ХВК). Полученные ПЦР фрагменты были секвенированы, произведена сборка контигов, в результате чего была определена полная нуклеотидная последовательность генома ХВК «Ока-2». Анализ полученной нуклеотидной последовательности свидетельствует о сходстве между ХВК «Ока» и стандартным ХВК как на уровне нуклеотидных последовательностей, так и общей организации генома. Как и стандартный ХВК, «Ока-2» содержит 4 гена: ген РНК-зависимой РНК – полимеразы, гены тройного блока гена, функции которых связаны с межклеточным транспортом вируса, а также ген белка оболочки. Геномы обоих вирусов имеют длину 6435 нуклеотидов, общее число замен нуклеотидов – 310 (4,8%), аминокислотных замен – 37 (1,8% всех аминокислот). Роль этих различий в повышении инфекционности вируса будет являться предметом дальнейших исследований.

Фрагменты к-ДНК вирусного генома были получена с помощью обратной транскрипции с использованием специфических праймеров. Два перекрывающихся фрагмента генома были получены с помощью ПЦР-амплификации к-ДНК с использованием двух пар праймеров. Полученные фрагменты были объединены в единый фрагмент ДНК, содержащий полную к-ДНК копию «Ока-2», который был клонирован под контролем 35S промотора в плазмидном векторе в E. coli. Корректность процедуры получения к-ДНК генома ХВК «Ока-2» была подтверждена в результате полного секвенирования полученного клона. Инфекционность к-ДНК клона вируса «Ока-2» была показана в экспериментах по заражению растений Nicotianabenthamiana.