Рассохина О.И. Изучение связывания катионов с аптамером к тромбину 15-TBA
Аптамеры – это искусственно найденные с помощью метода SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) олигонуклеотиды, обладающие высоким сродством к белковым мишеням. Одним из наиболее перспективных аптамеров для разработки современных лекарственных препаратов является 15-звенный ДНК-аптамер 15-ТВА, эффективно ингибирующий тромбин – сериновую протеазу, играющую ключевую роль в регуляции системы гемостаза.
15-ТВА имеет следующую последовательность: d(GGTTGGTGTGGTTGG), и образует квадруплексную структуру. Два G-квартета в его структуре соединены одной Т-G-T и двумя Т-Т петлями. Известно, что различные катионы, в том числе К+, стабилизируют квадруплексную структуру аптамера. Исходя из организации в пространстве нуклеотидной цепи, возможна реализация нескольких наиболее вероятных положений катионов внутри структуры 15-ТВА. Однако современные экспериментальные методы не позволяют напрямую установить местонахождение катиона в комплексе с 15-ТВА.
Общей задачей настоящей работы является установление геометрии и устойчивости комплексов аптамера с катионами с использованием экспериментальных и вычислительных методов.
Методами молекулярной динамики была изучена стабильность квадруплексной структуры 15-ТВА в отсутствие координирующих катионов. Были взяты полученные методом РСА и ЯМР структуры аптамера, различающиеся ориентацией нуклеотидной цепи. В результате было показано, что ЯМР-ориентация цепи в структуре аптамера при 0°С стабильна, что соответствует литературным данным.
В качестве основного экспериментального метода была выбрана изотермическая титрометрическая калориметрия (ITC), позволяющая установить стехиометрию и термодинамические эффекты связывания катиона с 15-ТВА. С ее помощью было проведено последовательное титрование 15-ТВА ионами К+ и Ва2+. Оказалось, что связывание аптамера с Ва2+ более устойчивое, и последующее связывание иона К+ невозможно, тогда как образующийся комплекс 15-ТВА с К+ связывает дополнительный ион Ва2+ с положительным энтропийным эффектом и высокой константой связывания.
Таким образом, в структуре 15-ТВА возможно наличие различных сайтов связывания ионов, и для их дальнейшего изучения выбраны мутанты исследуемого аптамера по одной из нижних и по верхней петле. Мутант по верхней петле (15-ТСТ) связывается с Ва2+, но с К+ не происходит связывания как чистого 15-ТСТ, так и комплекса 15-ТСТ с Ba2+.
Сравнительное изучение 15-ТВА и 15-ТСТ методом кругового дихроизма (КД) в 5 мМ растворе КС1 показало, что температура плавления 15-ТСТ (23 °С) ниже 15-ТВА (35°С). При этом анализ интенсивности пиков спектров КД показал, что пик в структуре 15-ТСТ выше. Экспериментальные данные позволяют предположить роль гуанина в TGT петле как запирающего калий элемента в квадруплексе. Это предположение также подтвердилось при изучении методом молекулярной динамики.
Дальнейшее изучение комплексов 15-ТВА с катионами важно для детального представления о структуре объекта и поможет в определении оптимальных условий связывания аптамера с тромбином.
Loading ...