РАЗРАБОТКА МЕТОДА ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА В ООЦИТЫ
Шеина Ю.И., Еремеев А.В.
Красноярский центр репродуктивной медицины, Красноярск (Россия), Красноярский государственный медицинский университет, Красноярск (Россия), Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва (Россия).
E-mail: shein1@mail.ru.
Различные нарушения фертильности затрагивают приблизительно 15% супружеских пар во всем мире, связанные по большей части с нарушением гаметогенеза. Недавние работы показали возможность получения половых клеток из эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) мыши. Сходные исследования проводились и с человеческими стволовыми клетками. Дальнейшее развитие методов дифференцировки человеческих эмбриональных стволовых клеток в ооциты, так и сперматозоидов может привести к появлению новейших методов лечения бесплодия. В связи с этим целью настоящей работы было получение дифференцированных ооцито-подобных дериватов из ЭСК человека с помощью разработанного протокола под контролем скрининга экспрессии специфических молекулярных маркеров гаметогенеза.
Человеческие эмбриональные клетки 49-ой линии культивировались на стандартной среде для эмбриональных стволовых клеток с добавлением BMP4, EGF, ретиноевой кислоты, фолликулостимулирующего и лютеинезируещего гормонов. Культивирование клеток проводилась в течение 3-х недель. Для идентификации прохождения клетками стадий дифференцировки, каждые 3 дня проводился забор клеток для проведения обратной транскрипции и ПЦР для анализа экспрессии следующих маркеров: Oct4, ifitm3, DPP A3, vasa, DAZL, ZP3.
На данном этапе работы культивирование клеток в среде, содержащей BMP4 приводило к дифференцировке колоний ЭСК. Оценивалась морфологий колоний методом простой фазово-контрастной микроскопии. Было обнаружена плотностно-зависимая способность колоний к дифференцировке. Дифференцировка культуры в лог-фазе происходила по всей колонии, а при практически монослойной – только по периферии. Следующим этапом работы планируется исследование экспрессии генов маркеров половых клеток на различных этапах дифференцировки.
Loading ...