BioScience Blog – Научный Биологический блог

Выяснение роли минорных протеиназ бацилл, доля которых в общем пуле протеолитической активности штамма не превышает 10%, представляет особый интерес для исследования. Одним из таких ферментов является исследуемая нами металлопротеаза штамма В. intermedius3-19. Ген металлопротеазы был клонирован в протеазодефицитный штамм В. subtilisBG2036. Нуклеотидная последовательность гена была конвертирована в аминокислотную последовательность белка, исходя из которой была рассчитана молекулярная масса фермента – 19 кДа. На основании гомологии с

другими ферментами исследуемая протеиназа была отнесена к семейству Ml2 клана MB.

Протеолитическая активность обнаруживается в культуральной жидкости и её уровень достигает своего максимума на 29-31 час роста, что соответствует стационарной фазе роста культуры. Активность рекомбинантного штамма ингибируется о-фенантролином – специфическим ингибитором металлопротеаз и не ингибируется специфическими ингибиторами сериновых протеиназ. В качестве первого этапа выделения белка было выбрано дробное фракционирование сульфатом аммония. В интервале насыщения 0,2 – 0,7 степень очистки белка составила 20, а выход белка почти 50%. Последующая очистка полученной фракции белка на бацитрацин-силохроме повысила степень очистки белка ещё в 50 раз, выход при этом составил 19%. SDS-электрофорез данной фракции показал наличие 4-х полос, поэтому в дальнейшем мы использовали 2 способа очистки. Первый – это применение ионообменной хроматографии на анионообменнике DEAE-целлюлозе и катионообменнике КМ-целлюлозе. Хроматография на DEAE-целлюлозе позволила повысить степень очистки белка в 6,4 раза. Хроматография на КМ-целлюлозе оказалась менее эффективной, поэтому в дальнейшем не использовалась. SDS-электрофорез фракции белка после очистки на DEAE-целлюлозе показал наличие 3-х полос. Вторым способом очистки белка явилась хроматография на гидрофобном носителе бутил-сефарозе. В результате был получен препарат белка, степень очистки которого возросла в 2,8 раза, и выход составил 33 %. SDS-электрофорез данной фракции показал наличие только одной полосы белка. На основании рисунка электрофореза было установлено, что молекулярная масса металлопротеазы соответствует приблизительно 17 кДа, что соответствует расчетам, полученным предварительно на основании нуклеотидной последовательности гена. На гомогенном препарате были исследованы некоторые энзиматические свойства белка: рН-оптимум как и рН-стабильность находится в пределах 7,2 – 7,4; фермент стабилен в интервале температур от 37 до 65°С, максимальную активность проявляет при 65°С. Таким образом, нами впервые разработан способ получения гомогенного препарата новой металлопротеазы В. intermediusиз культуральной жидкости рекомбинантного штамма В. subtilisс использованием хроматографии на гидрофобном носителе.