BioScience Blog – Научный Биологический блог

Тимус, являясь первичным органом иммунной системы, играет важную роль в поддержании иммунитета в любом возрасте. Существующие на сегодняшний день методы, такие как томография груди, УЗИ и подсчет фенотипически наивных клеток циркулирующих в периферической крови, дают представление о работе тимуса лишь на основе косвенных показателей. Наиболее остоверныйд способ оценки продуктивной функции тимуса — определение количества недавних эмигрантов (RTE) с TREC (T cell Receptor Excision Circles) в качестве маркера [1] методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) [2]. Разработанный и широко применяемый зарубежными исследователями метод, к сожалению, на

сегодняшний день не нашел своего применения в отечественных науке и практике в силу дороговизны используемых реагентов.

Цель исследования — оценка возможности определения функции тимуса методом ПЦР-РВ в условиях современной отечественной лаборатории с использованием недорогих систем российского производства.

В качестве контроля работы метода использовалась возрастная модель изменения функции тимуса [3]. Проведено сравнение 4 наборов для выделения нуклеиновых кислот из плазмы и цельной крови (три отечественных набора разных производителей и один западного производства). В дальнейшей работе был использован вариант наиболее подходящий по соотношению цена/качество. Сконструированы и проверены три пары праймеров к последовательности sj-TREC ранее описанные в зарубежных статьях. Для проверки использован метод End Point PCR с последующей разгонкой льтатоврезу на горизонтальном гель-электрофорезе. Ампликон длиной 374пн экстрагировался из агарозного геля с целью проверки специфичности праймеров. Повторная реамлификация подтвердила литературные данные. Используя разные концентрации Mg2+, dNTP, праймеров, интеркалирующего красителя, и их комбинаций была подобрана оптимальная концентрация компонентов реакционной смеси и температурный режим с наилучшим показателем выхода специфического продукта. Температура отжига праймеров исследовалась в диапазоне 58-68оС. Выбрана оптимальная температура 65оС. Первичные результаты анализа возрастной динамики RTE согласуются с литературными данными.

В дальнейших исследованиях предполагается апробация метода определения количества TREC при помощи ПЦР-РВ у пациентов с ВИЧ-инфекцией [4] до и после применения лекарственных препаратов, что позволит судить об эффективности проведенной терапии.

Литература

1.                Douek D.C.
et al.
Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection // Nature. – 1998. – V. 396. – P. 690-695.

2.                A-Z Quantitative PCR / Ed. S.A. Bustin, Ed. I.S. Tsigelny. – La Jolla, USA,2003.-P. 882.

3.             By Linqi Z. et al. Measuring recent thymic emigrants in blood of normal and HIV-1-infected individuals before and after effective therapy // J. Exp. Med. – 1999.-V. 190.-P. 725-732.

4.                     Franco J.M. et al. T-cell repopulation and thymic volume in HIV-1-infected adult patients after HAART // Blood. – 2002. – V. 99. – P. 3702-3706.