BioScience Blog – Научный Биологический блог

Метод адсорбционной иммобилизации клеток микроорганизмов широко используется в различных отраслях биотехнологии, в том числе процессах биокатализа и при решении экологических проблем [1]. Иммобилизованные    микроорганизмы    характеризуются    повышенной жизнеспособностью, устойчивостью к действию неблагоприятных факторов внешней среды и высокой каталитической активностью, которая во многих случаях возрастает в несколько раз по сравнению со свободными клетками [2]. Ранее нами изучен процесс иммобилизации клеток родококков на твердом носителе в биореакторе с перемешиванием при различных гидродинамических условиях, построена математическая модель, адекватно описывающая кинетику данного процесса [3]. На основании построенной модели рассчитаны показатели эффективности иммобилизационного процесса (степень иммобилизации, время иммобилизации и десорбции бактериальных клеток, коэффициент увеличения числа свободных клеток в результате распада клеточного мицелия) и показана возможность оптимизации биотехнологических процессов с использованием иммобилизованных микроорганизмов в условиях биореактора. Целью настоящей работы было изучение процесса биодеградации нефтяных углеводородов иммобилизованными клетками родококков в лабораторном колоночном биореакторе.

В работе использовали штаммы Rhodococcus ruber ИЭГМ 615 и
Rhodococcus opacus ИЭГМ 249 из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, #768 во Всемирной Федерации коллекций культур (WFCC), www.iegm.ru/iegmcol). Родококки выращивали в 250-мл колбах Эрленмейера, содержащих 100 мл мясопептонного бульона (Oxoid Ltd, Англия), на орбитальном шейкере (150 об/мин) при 28°С в течение 24 ч. Иммобилизацию клеток родококков проводили в колоночном биореакторе (12,0 x 1,4 см), заполненном гидрофобизованным древесным опилом [4] с размером частиц d . 1—3 В В качестве инокулята использовали суспензию (2,0 x 107 кл/мл; 200 мл) клеток R. ruber и R. opacus, взятых в равном соотношении. Клеточную суспензию подавали в биореактор с помощью перистальтического насоса со скоростью 0,6 и 1,2 мл/мин в течение 6 сут. Процесс иммобилизации контролировали путем измерения оптической плотности (ОП600нм) суспензии на спектрофотометре Lambda EZ 201 (Perkin Elmer, США). Динамику процесса биодеградации нефтяных углеводородов иммобилизованными клетками родококков изучали с использованием 2%-ной эмульсии модельной нефти (н-С10, н-С11, н-С12, н-С14, н-С16, н-С17, н-С19 – 12%; пристан – 6%; нафталин, фенантрен, антрацен – 2%) в минеральной среде RS [5], стабилизированной 0,1%-ным р-ом твина 60. Эмульсию подвергали УЗ-обработке (24 кГц, 1 мин) и пропускали через колонку со скоростью 0,6 и 1,2 мл/мин при 30°С в течение трех недель. Количественное содержание углеводородов в образцах из биореактора определяли после экстракции хлороформом с помощью газового хроматографа Agilent 6890N, снабженного масс-спектрометрическим детектором Agilent MSD 5973 N (Agilent Technologies, США). Определение дыхательной активности иммобилизованных клеток родококков проводили с использованием респирометра Micro-Oxymax® (Columbus, США). При этом количество потребленного кислорода и выделенного углекислого газа в присутствии модельной нефти было взято как функция от времени для иммобилизованных клеток и неинокулированного носителя.

По нашим данным, процесс иммобилизации родококков в колоночном биореакторе характеризовался относительно равномерным снижением показателя оптической плотности клеточной суспензии на протяжении всего периода инкубирования. В результате около 40% бактериальных клеток адсорбировалось на поверхности носителя. Эффективность биодеградации (рис. 1) модельной нефти иммобилизованными клетками родококков составила 77%. При этом родококки проявляли определенную специфичность при окислении различных углеводородов. Так, максимальная (75-100%) степень деградации наблюдалась для н-алканов с длиной углеродной цепи С10-С19 и пристана. Наименее эффективно происходила биодеградация нафталина (30%), а также фенантрена и антрацена (66 и 68% соответственно). Следует отметить, что двукратное (от 0,6 до 1,2 мл/мин) увеличение скорости подачи нефтяной эмульсии в биореактор приводило к снижению продолжительности деградационного процесса от трех до двух недель. Полученные результаты могут быть использованы при оптимизации биотехнологических процессов очистки нефтезагрязненных сточных вод в промышленных биореакторах.

В результате респирометрических исследований   установлено, что родококки в иммобилизованном состоянии характеризуются стабильно высокой дыхательной активностью (удельная скорость потребления кислорода в присутствии нефтяных углеводородов составила 0,32 мкл·мин-1 мг-1 сухих клеток), поддерживаемой в течение трех недель. Полученные данные свидетельствуют о высокой жизнеспособности и функциональной стабильности иммобилизованных клеток родококков, а также возможности их эффективного применения в качестве биокатализатора окисления углеводородных поллютантов. Более того, нами обнаружено (рис. 2), что после операционного цикла обработки нефтезагрязненной воды в колоночном биореакторе наблюдается двукратное повышение респирационной активности иммобилизованного биокатализатора что указывает на возможность его многократного использования. На основании полученных результатов можно сделать вывод о целесообразности использования иммобилизованных клеток родококков в биотехнологическом процессе очистки нефтезагрязненной воды и эффективности проведения данного процесса в колоночном биореакторе.

Исследования выполнены при поддержке гранта Президента РФ "Ведущие научные школы" №НШ-4112.2008.4 и программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».

Литература

1.                                        Ившина И.Б. и др. Эффективное извлечение цезия клетками бактерий рода Rhodococcus // Микробиология. – 2002. – Т. 71, № 3. – С. 418-423.

2.                                        Егоров Н.С. и др. Биосинтез биологически активных веществ иммобилизованными клетками микроорганизмов // Прикл. биохим. и микробиол. – 1984. – Т. 20, вып. 5. – С. 579-592.

3.                                         Куюкина   М.С.    и   др.    Кинетическая   модель    процесса иммобилизации на твердом носителе // Росс. журн. биомеханики. − 2007. — Т. 11,№2.−С. 79-87.

4.                                         Podorozhko E.A. et al. Hydrophobised sawdust as a carrier for immobilization of the hydrocarbon-oxidizing bacrerium Rhodococcus ruber // Biores. Technol. – 2008. – V. 99, № 6. – P. 2001-2008.

5.                                         Каталог штаммов региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов // Под ред. И.Б. Ившиной. М.: Наука, 1994.− 163 с.