BioScience Blog – Научный Биологический блог

Карбоксилэстеразы (КФ 3.1.1.1) млекопитающих – сериновые гидролазы широкого спектра действия, катализирующие гидролиз эфирной и амидной связей в молекулах структурно отличных соединений, в том числе лекарственных препаратов, обладают широкой субстратной специфичностью и высокой стереоселективностью, благодаря чему являются перспективными катализаторами стереоселективного гидролиза и синтеза.

Цель данной работы – исследование гидролиза сложных эфиров 1,4-бенздиазепин-2-она выделенным частично очищенным препаратом карбоксилэстераз печени свиньи (КЭПС).

Микросомальную фракцию (МФ) выделяли методом низкоскоростной седиментации (10000 g) в присутствии ионов Са2+; замена солюбилизации МФ дезоксихолатом Na на экстракцию 0,1 моль/дм3 раствором пирофосфата Na с последующим фракционированием (NH4)2SO4 (45-70 % насыщения) позволила повысить выход по белку и эстеразную активность препарата КЭПС в 10,9 и 3,9 раз, соответственно, в сравнении известными методами Kato R.; Nilsson О. and Dallner G. Показано, что экстракция осадка (фракция 0-45 % – ного насыщения) привела к увеличению суммарной эстеразной активности препарата на 26 %, составившую 148,7 мкмоль а-нафтола/мг белка-мин.

Изучение фракционного состава методом SDS-электрофореза в 10 %-ном ПААГ показало наличие 26 белковых фракций, которые можно объединить в 4 зоны. 1 и 2-я зоны (Rf 0,92-0,51; М.м.14,4±3,0 – 41,7±4,5 кДа) представлены балластными белками и продуктами деградации, белки наиболее выраженной 3-й зоны (Rf 0,45-0,23) с М.м. 52,5 ±5,8 – 69,3 ± 7,6 кДа (43,1 %) могут соответствовать субъединицам а, Р, у молекулы карбоксилэстеразы. 4-я зона (Rf 0,22-0,10; М.м. 82,2±10,0 – 300,0±36,0) представлена продуктами агрегации молекул КЭПС и балластных белков.

Методом нативного электрофореза в ПААГ показано, что 11 белковых фракций (73 % общего белка) ферментного препарата обладают выраженной эстеразной активностью.

Доказательством природы выделенного фермента является выявленное полное ингибирование эстеразной активности (0,25 ед) селективным ингибитором КЭПС ди-(и-нитрофенил)фосфатом (180,2 мкмоль/дм3).

Выделенный препарат КЭПС в разработанных условиях (рН 8,0, t 37 °С, т 2,5 час) катализировал гидролиз сложных эфиров: 3-метил – (I), 3-этил- (II), 3-пентил – (III), 3-гексил – (IV), 3-гептилкарбонилокси-7-бром-5-фенил-1,2-дигидро-ЗН-1,4-бенздиазепин-2-она (V), с образованием в качестве конечного продукта 7-бром-3-гидрокси-5-фенил-1,2-дигидро-ЗН-1,4-бенздиазепин-2-она, структура которого подтверждена комплексом физико-химических методов: ТСХ, УФ-спектроскопии, масс-спектрометрии.

Гидролитическая активность КЭПС в отношении сложных эфиров 1,4—бенздиазепин-2-она отличается; так, степень трансформации соединений III, IV, V составила 53, 2 %, 48,1 % и 46,1 %, соответственно, в то время как I и II гидролизуются в этих же условиях на 38,3 % и 44,0 %, что свидетельствует о большей специфичности карбоксилэстеразы микросомальной фракции печени свиньи к исследованным субстратам с длиной углеродной цепи (С5-С7) ацильного фрагмента.