BioScience Blog – Научный Биологический блог

На сегодняшний день актуальным является изучение роли клеток костномозгового происхождения в процессах физиологической репарации и патологического ремоделирования тканей на модели животных с маркированными клетками костного мозга. Для маркирования этих клеток одним из наиболее перспективных является метод генетических конструкций на основе лентивирусов. Данные конструкции позволяют осуществить трансгеноз неделящихся клеток, в том числе стволовых клеток костного мозга. Такой подход представляется особенно актуальным в свете недавно полученных данных, подтверждающих прямое участие костномозговых прогениторных элементов в ремоделировании поврежденной сосудистой стенки, в частности, в развитии интимальной гиперплазии. Это создает предпосылки для использования костномозговых предшественников эндотелиальных и гладкомышечных клеток в качестве средств доставки терапевтических генов в область репарации. В связи, с чем актуальной задачей является разработка эффективного метода трансдукции данного типа клеток, который обеспечит стабильную экспрессию трансгена в их дифференцированных потомках in vivo.

Настоящая работа посвящена выявлению маркированных красным флуоресцентным белком (dsRed) клеток костного мозга и крови у радиационных костномозговых химерных мышей. Кроветворение химерных мышей было восстановлено клетками обогащенных субпопуляций костного мозга с фенотипами Lin-c-kit+ и Lin-c-kit+Sca-1+, прошедшими in vitro трансдукцию с помощью генетической конструкции на основе лентивируса HIV-1, несущей ген dsRed, методом трансдукции ex vivo. Целью исследования являлось проведение анализа экспрессии dsRed в клетках костного мозга и периферической крови химерных мышей через 1-11 месяцев после восстановления кроветворения. Флуоресценцию dsRed в клетках костного мозга и крови определяли методом поточной цитофлуориметрии. Выявление нуклеотидных последовательностей Y-хромосомы и фрагмента генетической конструкции в геноме исследуемых клеток проводили с помощью полимеразной цепной реакции. Флуоресценция dsRed в клетках костного мозга и крови химерных животных была выявлена на 1, 4, и 11 месяц после восстановления кроветворения. При восстановлении кроветворения маркированными клетками субпопуляций Lin-c-kit+ и Lin-c-kit+Sca-1+ количество флуоресцирующих клеток составило соответственно до 3% и до 1%. Анализ ДНК, выделенной из клеток костного мозга химерных самок, выявил наличие Y-хромосомного маркера, что свидетельствует о донорском происхождении этих клеток. Анализ ДНК клеток костного мозга химерных мышей, кроветворение которых было восстановлено трансдуцированными клетками, выявил наличие вирусного маркера PROSIH, что подтверждает стабильность интеграции генетической конструкции. Полученные результаты говорят о том, что кроветворение может быть длительно восстановлено клетками выбранных субпопуляций, т.е. среди них присутствуют примитивные костномозговые клетки-предшественники. Эти клетки могут подвергаться лентивирусной трансдукции in vitro и служить подходящим инструментом для маркирования костномозговых клеток ex vivo.