BioScience Blog – Научный Биологический блог

Антибиотикорезистентность является одной из самых актуальных проблем современной микробиологии и медицины. Решение этой проблемы исключительно путём разработки новых антибактериальных препаратов невозможно — резистентные формы микроорганизмов обнаруживаются уже через несколько лет после введения антибиотика в клиническую практику. Необходимы иные подходы, в том числе, основанные на подавлении механизмов формирования резистентности. В связи с этим, детальное изучение молекулярных основ адаптации бактерий к действию антибиотиков приобретает особую значимость.

Цель данной работы — изучение роли полиаминов в приспособлении Escherichia coli к действию сублетальных концентраций одних из наиболее используемых в клинике антибактериальных препаратов — фторхинолонов.

Экспрессию исследуемых генов определяли с использованием lacZ генных слияний по активности β-галактозидазы [1]. Внутриклеточное содержание полиаминов рассчитывали по результатам тонкослойной хроматографии их дансилированных производных [2]. Выживаемость бактериальных клеток оценивали как отношение числа колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл культуры, подвергнутой неблагоприятному воздействию, к КОЕ нестрессированной культуры.

Первый этап исследований касался изучения экспрессии rpoS — гена, кодирующего глобальный регулятор общего стрессового ответа E. coli. Нами показаноение, что внес в периодическую культуру сублетальных концентраций фторхинолоновых антибиотиков пефлоксацина и левофлоксацина (0,038 и 0,012 мкг/мл соответственно) вызывает приблизительно 5-кратное возрастание экспрессии rpoS к 4 часу стрессового воздействия в сравнении с контролем. Это сопровождается повышением содержания внутриклеточных полиаминов: путресцина (в 2-3 раза) и кадаверина (в 5-6 раз).

С целью изучения возможной адаптивной функции полиаминов при воздействии антибиотиков исследовали их эффект на экспрессию rpoS в условиях добавки пефлоксацина в полиаминдефицитных штаммах E. coli.
Внесение 5 мМ путресцина вызывало 35-40% возрастание экспрессии rpoS к 4-му часу действия антибиотика. Эффект спермидина (2 мМ) был менее выражен — уровень RpoS в клетке увеличивался лишь на 15%. Влияния кадаверина (2 мМ) на экспрессию rpoS отмечено не было. Следовательно, путресцин и спермидин, повышая экспрессию гена множественной стрессорной устойчивости rpoS, могут усиливать адаптивный потенциал клеток в условиях воздействия антибиотиков.

В качестве конечного критерия возможности участия полиаминов в адаптации к действию антибиотиков была исследована выживаемость бактериальных клеток. Внесение 5 мМ путресцина в культуру E. coli,
подвергнутую действию левофлоксацина, приводило к 2-кратному возрастанию КОЕ уже через 50 минут после начала стрессового воздействия. Этот эффект сохранялся и в более поздних пробах.

Таким образом, наблюдаемое в ответ на добавку фторхинолонов возрастание внутриклеточной концентрации полиаминов способствует повышению устойчивости бактериальных клеток к действию этих антибиотиков. Одним из механизмов этого явления служит полиамин-зависимая стимуляция экспрессии rpoS. Различия эффектов изученных полиаминов на экспрессию данного гена позволяют предполагать возможность их функциональной специализации.

Работа выполнена по программе Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и поддержана грантом РФФИ 07-04-96003-р_урал_а.

Литература

1.                   Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. — М.: Мир, 1976.-438 с.

2.                                Чудинов А.А. и др. Метод определения низкомолекулярных олигоаминов в различном биологическом материале // Вопросы мед. химии. – 1984. – Т. 30, вып. 4. – С. 127-132.