BioScience Blog – Научный Биологический блог

В семейство 14-3-3 входят семь близкородственных белков, широко распространенных в клетках эукариот и способных образовывать устойчивые гомо – или гетеродимеры. Белки 14-3-3 являются универсальными адаптерными белками и способны взаимодействовать с более чем 200 различными белками-мишенями. При этом 14-3-3 преимущественно взаимодействуют с белками, содержащими фосфорилированные остатки серина или треонина в определенных консенсусных последовательностях. Выступая в качестве универсального адаптора, белки 14-3-3 принимают участие в передаче сигнала, регуляции апоптоза и клеточного цикла. Активность белков 14-3-3 может регулироваться путем фосфорилирования остатков Ser58, Ser184 и Thr232, однако влияние указанных модификаций на структуру и свойства 14-3-3 остается малоизученным. В связи с экспериментальными сложностями получения полностью фосфорилированных белков было проведено мутирование указанных остатков и получены мутантные белки S58E, S184E, T232E и S58E/S184E/T232E, имитирующие фосфорилирование. По данным кругового дихроизма в далекой ультрафиолетовой области мутация S58E слабо влияет на вторичную структуру 14-3-3, однако вызывает 15-20% увеличение триптофановой флуоресценции белка и усиливает его способность связывать гидрофобный зонд бис-АНС. Мутация S58E, имитирующая фосфорилирование 14-3-3, сильно повышает чувствительность белка к протеолизу. Точечные мутации S184E и T232E не оказывают существенного влияния на вторичную и третичную структуру 14-3-3?, его чувствительность к действию протеаз, а также на его флуоресцентные и гидрофобные свойства. По данным гель-фильтрации и аналитического ультрацентрифугирования гидродинамические свойства S184E и T232E мало отличаются от свойств белка дикого типа, в то время как мутанты S58E и S58E/S184E/T232E при низкой концентрации белка обладают значительно меньшим радиусом Стокса и коэффициентом седиментации, чем белок дикого типа. Это может означать, что мутация S58E увеличивает вероятность диссоциации димеров 14-3-3. Действительно, при электрофорезе в отсутствие денатурирующих агентов электрофоретическая подвижность мутантов S58E и S58E/S184E/T232E была заметно выше подвижности белка дикого типа или его S184E и T232E мутантов. Химическое «сшивание» диметилсуберимидатом устраняет различия в электрофоретической подвижности исследуемых белков, что может быть обусловлено предотвращением диссоциации димеров 14-3-3. Таким образом, мутация S58E, имитирующая фосфорилирование 14-3-3? по остатку серина-58, приводит к существенным изменениям физико-химических свойств белка. Указанные изменения могут модулировать взаимодействие 14-3-3 с различными белками-партнерами и, возможно, скорость деградации 14-3-3 в условиях invivo.