BioScience Blog – Научный Биологический блог

Оксид азота (NO), непрерывно вырабатываемый в организме животных и человека из L-аргинина при участии семейства ферментов NO-синтаз (NOS), является одним из важнейших биологических медиаторов в организме высших эукариот и вовлечен в регуляцию множества физиологических и патофизиологических процессов [1]. В связи с этим перспективным направлением современной медицины является применение NO в качестве теpапевтичеcкого агента, однако большинство известных химических доноров оксида азота нестабильны в физиологических условиях, поставляя NO слишком быстро и на тяжело контролируемом уровне [2]. Адекватным решением данной проблемы является использование микроорганизмов. Сегодня точно известно, что некоторые бактерии, подобно кариотклеткам эу, способны синтезировать оксид азота при участии фермента NO-синтазы [3]. Ввиду известной биологической активности бактерий рода Lactobacillus исследование NOS у микроорганизмов этой группы, как у потенциальных пробиотиков — регуляторов синтеза NO в макроорганизме, представляет особый интерес. Ранее методами ЭПР-спектроскопии нами было установлено, что бактерии Lactobacillus plantarum 8Р-А3, подобно клеткам млекопитающих, обладают NO-синтазной активностью [4].

Цель настоящей работы — исследование регуляции активности NOS лактобацилл субстратом L-аргинином, а также идентификация соответствующей бактериальной NO-синтазной (bNOS) белковой фракции в клетках L. plantarum 8Р-А3.

Для регистрации оксида азота лактобацилл впервые использовали метод флуоресцентного окрашивания и микроскопии. Установили, что внесение в среду культивирования бактерий различных концентраций субстрата NO-синтазы L-аргинина приводит к существенному дозозависимому увеличению продукции NO, но не влияет на динамику роста культуры. Для определения молекулярных детерминант NOS в клетках лактобацилл был проведен вестерн-блот анализ с использованием мышиных антител к нейрональной (nNOS), эндотелиальной (eNOS) и

индуцибельной (iNOS) изоформам NOS. Показано, что значительный диапазон фракций клеточного лизата исследуемых бактерий характеризуется связыванием с использованными антителами не зависимо от присутствия L-аргинина в среде культивирования. Наиболее интенсивный и дифференцированный сигнал зафиксирован в случае использования антител к nNOS (рис. 1), при котором детектировали белковые фракции с молекулярным весом около 43 и 95 кДа, что согласуется с данными литературы о молекулярной массе bNOS [2].

Таким образом, нами установлена прямая зависимость между синтезом NO бактериями L. plantarum 8Р-А3 и концентрацией вносимого субстрата NOS L-аргинина, а также определены белковые фракции клеточного лизата исследуемых лактобацилл, которые могут соответствовать димерной и мономерной форме bNOS. Дальнейшее исследование особенностей NO-синтазы лактобацилл представляется особенно актуальным ввиду возможности создания пробиотических препаратов, корректирующих количества NO в макроорганизме.

Работа поддержана грантами РФФИ (07-04-01051, 09-04-97032) и программой РНП (2.1.1/920). Авторы выражают благодарность Бойерляйну К. (Институт фармакологии, Гиссен, Германия) за помощь в проведении флуоресцентной микроскопии.

Литература

1.                                        Ванин А.Ф. Оксид азота — регулятор клеточного метаболизма // Соросовский образовательный журнал. – 2001. – Т. 7, № 11. – С. 7-12.

2.                                         Gusarov I. et al. Bacterial NO-synthases Operate without a Dedicated Redox Partner // J. Biol. Chem. – 2008. – V. 283, № 19. – P. 13140-13147.

3.                                         Takami H. et al. Complete genome sequence of the alkaliphilic bacterium Bacillus halodurans and genomic sequence comparison with Bacillus subtilis // Nucleic Acids Res. – 2000. – V. 28. – P. 4317-4331.

4.                                       Яруллина Д.Р. и др. Альтернативные пути образования NO у лактобацилл: обнаружение возможной NO-синтазной активности методом ЭПР // Микробиология. – 2006. – Т. 75, № 6. – С. 731-736.