BioScience Blog – Научный Биологический блог

В настоящее время клетки микроорганизмов с успехом применяются во многих процессах трансформации органических соединений. Использование их в качестве биокатализаторов может оказаться более оправданным по сравнению с ферментативными препаратами. Важнейшим преимуществом интактных клеток является возможность их регенерации и многократного использования [1,2]. В связи с этим актуальной задачей является поиск новых эффективных микроорганизмов, содержащих высокоактивные ферменты, с целью создания на их основе биокатализаторов.

Цель работы — изучение спектра субстратной специфичности, а также влияние различных факторов на активность эстераз выделенных штаммов.

Объектами исследования явились ранее выделенные почвенные грамотрицательные микроорганизмы [3].

Определяли минимальную подавляющую концентрацию (МПК) эфиров по отношению к селектированным культурам. Обнаружили, что для всех восьми штаммов характерна параболическая кривая, описывающая изменение МПК при удлинении длины углеродной цепи исследуемых эфиров. МПК для метилацетата и этилацетата составляла 1,03-1,6 М, для бутил – и изобутилацетата — 0,63-0,67 М, пентил – и изопентилацетат были наиболее токсичны для данных микроорганизмов: МПК равна 0,35 М. С удлинением лероднойуг цепи МПК возрастала до 0,73 М для гексилацетата, 1,4 М для пентилвалерата, и наименее токсичным в данном ряду был этилдеканоат — МПК равна в среднем 1,97 М (рис. 1). Известно, что пентилацетат и изопентилацетат являются компонентами эфирных масел ряда растений, служащих, в том числе, и для защиты от патогенных микроорганизмов.

Исследовали карбоксиэстеразную активность селектированных микроорганизмов в отношении ряда ацетатных эфиров в концентрации 10 мМ. Обнаружили, что штаммы Pseudomonas myxogenes ОН1, ОН5, ОН6 и Pseudomonas sp. ОВ1 конвертируют преимущественно бутил-, изобутил – и пентилацетат с удельной активностью 0,60-1,60 МЕ (мкмоль/мин/мг сухого веса клеток), штаммы Alcaligenes sp. ОН8, Brevundimonas sp. ЛН3 и Pseudomonas sp. ЛН4 имеют более широкий спектр предпочтительных субстратов с удельной активностью 1,60-3,80 МЕ. Конверсионная способность штамма Pseudomonas
sp. ЛВ3 возрастала прямо пропорционально с удлинением углеродной цепи исследуемых эфиров с 0,20 МЕ на метилацетате до 2,77 МЕ на гексилацетате.

Изучали влияние температуры проведения реакции на активность эстеразы выделенных штаммов. Клетки инкубировали вместе с субстратом при заданной температуре. Обнаружили, что исследуемые культуры проявляют высокую активность в диапазоне от 25оС до 50 оС, штамм ЛВ 3 имел максимум активности при температуре 30оС.

Таким образом, эстеразы тестерных штаммов относятся к группе мезофильных ферментов. При 60оС для всех штаммов зарегистрировано повышение активности, что, возможно, связано с нарушением проницаемости клеточной стенки и выходом интрацеллюлярных ферментов.

В дальнейшем планируется выделение фермента и изучение каталитических характеристик очищенной эстеразы, а также разработка протоколов ПЦР-анализа для обнаружения генов карбоксиэстераз.

Исследования поддержаны грантом РФФИ 07-04-96071 и программой Президиума РАН «Биологическое разнообразие».

Литература

1.                              Коновалов А. А. Разработка методов разделения рацемических эфиров с помощью гидролаз микроорганизмов // Автореф. дисс. …канд. техн. наук. – Уфа, 2002. – 25 с.

2.               Мубараков А.И. Разработка энантиоселективных биокатализаторов парциального ацилирования спиртов // Автореф. дисс. …. канд. техн. наук. — Уфа, 2002.-25 с.

3.                            Старкова М.К., Ремезовская Н.Б. Селекция грамотрицательных микроорганизмов,    обладающих    эстеразной    активностью    //    Сб. «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии». — Екатеринбург-Пермь, 2007. – С. 107-109.