BioScience Blog – Научный Биологический блог

Перспективным подходом к исследованию ранних этапов дифференцировки является выявление генов, специфически транскрибируемых при индукции морфогенеза, и изучение их влияния на регенерацию растений. В Венском университете была выделена последовательность ДНК, специфически транскрибируемая в микроспорах растений табака, индуцированных к соматическому эмбриогенезу холодовым стрессом. Первичный анализ функции исследуемого гена с помощью инактивации антисмысловой конструкцией (RNAi) показал необходимость ntsm10 для образования и развития эмбриоидов из микроспор. Целью данной работы было изучение влияние гена ntsm10 на индукцию органогенеза у тканей табака. Объектами работы было 6 трансгенных гомозиготных линий табака (Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1), в том числе две с инактивированным геном ntsm10 и две – с восстановленной активностью гена. В качестве контроля использовали интактные нетрансформированные растения того же сорта табака. Для оценки морфогенетического потенциала листовые диски или каллусы одинакового размера культивировали в стандартных условиях на среде Мурасиге-Скуга, содержащей 20 г/л сахарозы, а также ауксины и цитокинины в разных концентрациях. Учитывая большую роль фитогормонов в индукции морфогенеза, важно было оценить, не связана ли функция ntsm10 с восприятием или передачей гормонального сигнала. После месячного культивирования определяли долю эксплантов с побегами или с корнями и подсчитывали среднее число побегов на эксплант. На каждом варианте среды культивировали не менее 20 эксплантов одной линии. Если ген ntsm10 участвует в регуляции роста растений или морфогенеза, то его инактивация должна была вызывать отличия от интактных растений, а восстановление активности – возвращение к норме. Исходя из этого предположения оценивали результаты экспериментов. Листовые диски всех линий на всех 10 использованных средах образовывали каллус, побеги и корни. Частота каллусообразования составила 100% для всех линий и всех вариантов сред. Интенсивность побегообразования и корнеобразования зависела от соотношения ауксина и цитокинина. На большинстве сред доля листовых дисков, образовавших побеги, составила 90-100%. Частота корнеобразования в зависимости от соотношения гормонов варьировала от 0-100%. Уменьшение частоты ризогенеза у вариантов с инактивированным ntsm10 и восстановление до уровня контроля у линий с восстановленной активностью гена наблюдали у листовых дисков культивируемых на среде 0,5 НУК и 1 БАП. Каллусные ткани полученные из листовых эксплантов характеризовались на этой среде довольно активным побегообразованием при полном отсутствии ризогенеза. Инактивация гена ntsm10 вызывала увеличение доли каллусов с побегами до 100% и увеличение количества побегов на каллус в 3-4 раза по сравнению с контролем и вариантами с восстановленной активностью исследуемого гена. В стрессовых условиях, вызванных трехдневной инкубацией тканей при 6°С или добавлением в среду 0,6 М маннита, влияние гена ntsm10 на органогенез проявлялось сильнее. Таким образом, на среде с 0,5 мг/л НУК и 1,0 мг/л БАП инактивация исследуемого гена приводила к уменьшению частоты ризогенеза и усилению побегообразования. Выявленные в ходе работы различия между морфогенетическими реакциями растений с разной степенью экспрессии ntsm10 дают основание  предполагать,  что  этот ген  играет роль  не  только  в  регуляции эмбриогенеза, но и в других видах дифференциации клеток.