BioScience Blog – Научный Биологический блог

Михайлова Е.О., Каримова М.Р., Шарипова
М.Р.

К настоящему моменту подавляющее большинство протеаз, входящих в состав детергентов, – бактериальные сериновые протеазы. Субтилизиноподобные сериновые протеиназы, обладая широкой субстратной специфичностью, стабильностью при высоких значениях рН, активностью в широком интервале температур, устойчивостью к хелатирующим и окисляющим агентам, идеально подходят для использования в составе детергентов. Актуальным представляется поиск новых бактериальных протеиназ, сохраняющих активность в присутствии окислителей, денатурирующих веществ, а также в растворах с высокой ионной силой. Из культуральной жидкости B.subtilisс помощью ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе и высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке MonoS в системе FPLC были выделены 2 фракции субтилизиноподобной протеиназы, секретируемые на 28-й (первая фракция) и 48-й (вторая фракция) часы роста культуры.

Исследование влияния SDS на субтилизиноподобную протеиназу B. intermedius, секретируемую рекомбинантным штаммом B. subtilis, показало, что в присутствие данного денатурирующего агента в концентрации от 0,1 до 0,5 % активность первой и второй фракций протеиназы практически не изменялась, однако прединкубация обеих белковых фракций в течение 1 ч с SDS в концентрации от 0,2 до 5 % вела к полной потере активности ферментов. Показано, что фермент сохраняет активность в присутствие 10 мМ H2O2 на уровне контроля, активность обеих фракций незначительно снижалась в присутствие 20 и 40 мМ H2O2. Прединкубация субтилизиноподобной протеиназы B.intermediusс 10 и 20 мМ H2O2 в течение 1 ч также не оказывала существенного влияния на активность фермента, но в концентрации 40 мМ активность первой фракции снижалась на 40 %, а второй – на 25 %. Показано, что в присутствие низких концентраций этанола (5, 10 %) активность первой фракции протеиназы не снижалась, в отличие от второй фракции фермента. Высокие концентрации С2Н5ОН (25, 50 %) подавляли активность протеиназы более чем на 50 %. В присутствие NaCl (20 %) активность протеиназы повышалась на 30 %. Прединкубация обеих фракций протеиназы в течение 1 ч с NaCl привела к повышению активности первой фракции протеиназы на 75, а второй – на 50 %. Прединкубация обеих фракций с NaCl в течение 24 ч позволила повысить активность первой фракции протеиназы в 2 раза (10-20 % NaCl), а второй – в 2,5 – 3 раза (15-20 % NaCl). Такое увеличение активности субтилизиноподобных протеиназ B.intermediusза счет повышения ионной силы может быть связано с определенным вкладом гидрофобных взаимодействий в структуру молекулы белка. Полученные результаты свидетельствуют о возможных изменениях в конформации фермента при смене механизма регуляции его синтеза на разных стадиях роста культуры.