BioScience Blog – Научный Биологический блог

Кишечная микрофлора рыб — уникальное микробное сообщество, функциональная роль которого заключается в продукции ферментов, участвующих в расщеплении различных пищевых субстратов [1], в синтезе антибактериальных веществ, защищающих желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) от заселения аллохтонными и патогенными микроорганизмами [2]. В настоящее время исследования состава собственной микрофлоры рыб проводят традиционным культивированием и молекулярно-генетическими методами [3,4]. Кишечная микрофлора рыб озера Байкал активно изучается нами с применением молекулярно-генетического анализа [5]. Проведена адаптация методов и отработаны процедуры выделения ДНК из разных органов и тканей рыб [5]. Подобраны оптимальные условия амплификации бактериального продукта гена 16S рРНК на паре универсальных бактериальных праймеров, для получения максимального генетического разнообразия [5]. Нами показано, что для корректного определения генетического разнообразия микробных сообществ, следует использовать разные методы выделения суммарных нуклеиновых кислот [6]. Установлено, что для получения наиболее полных данных о генетическом разнообразии кишечной микрофлоры рыб, необходимо учитывать особенности структурно-функциональной организации их ЖКТ. Цель работы — изучить генетическое разнообразие микроорганизмов из ЖКТ черного байкальского хариуса по адаптированной методике.

Материалом для работы послужили три половозрелые особи черного байкальского хариуса (Thymallus arcticus baicalensis
Dybowski, 1874), отобранных в бухте Песчаная (Южный Байкал). Выделение суммарной ДНК проводили методами очистки с помощью цетавлона и ферментативного лизиса из среднего и заднего отделов кишечника. Полимеразную цепную реакцию, лигирование, клонирование и скрининг клонов проводили, как было описано ранее [5]. Секвенирование осуществляли на автоматическом секвенаторе ABI310A (ABI PRISM 310 Genetic Analyzer) в Новосибирском приборном центре коллективного пользования СО РАН. Последовательности проверяли на наличие химерных структур (http://rdp8.cme.msu.edu/ cgis/chimera), а также проводили сравнительный (http://www.ebi.ac.uk/fasta33/) и филогенетический (Mega v3.1) анализы.

Получены бактериальные ПЦР-продукты из 12 проб геномной ДНК. Для лигирования использовали суммарные ПЦР-продукты индивидуально для каждой особи. По результатам клонирования и последующего скрининга клонов получено 45 полноразмерных вставок. Для 44 из них проведено определение нуклеотидных последовательностей, их длина

варьировала от 720 до 891 п.о. Проверка полученных последовательностей выявила одну химерную структуру, которая была исключена из дальнейшего анализа. Сравнительным анализом показано присутствие в кишечнике рыб следующих филогенетических групп анизмовмикроорг: альфа-подгруппа протеобактерий (Azospirillum, Caulobacter, Sphingomonas), бета-подгруппа протеобактерий (Comamonas, Delftia), гамма-подгруппа протеобактерий (Aeromonas, Azotobacter, Escherichia, Pseudomonas, Salmonella, Stenotrophomonas) и группа Tenericutes (Mycoplasma). Филогенетический анализ выявил среди представителей рода Pseudomonas четыре различных кластера последовательностей. Одни из последовательностей рода Pseudomonas имеют высокую (99,2%) гомологию с бактериальными последовательностями (EF179845), выделенными из Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae). Другие представители рода Pseudomonas имеют гомологию (97,7%) с последовательностью (AY770429), полученной из кишечника Saperda vestita (Coleoptera: Cerambycidae). Полученные последовательности рода Mycoplasma
имеют гомологию (98,5%) с представителями Mycoplasma (FJ456769) из кишечника рыб семейства Notothenidae.

Таким образом, адаптированная методика позволяет получить широкое генетическое разнообразие микроорганизмов, ассоциированных с ЖКТ рыб.

Работа поддержана инновационным проектом «Тест-системы для диагностики бактериальных инфекций рыб» 2008 г. ИНЦ СО РАН и выполнена хв рамка программы РАН №23, подпрограммы 1, проект 23.13 (2009-2010 гг.).

Литература

1.                                   Уголев А.М., Кузьмина В.В. Пищеварительные процессы и адаптации у рыб. – СПб.: Гидрометеоиздат, 1993. – 238 с.

2.                          Извекова Г.И. и др. Симбионтная микрофлора рыб различных экологических групп // Известия РАН. Серия биологическая. — 2007. — № 6. – С. 728-737.

3.                        Austin B. The bacterial microflora of fish // The Scientific World Journal. – 2002. – V. 2. – P. 558-572.

4.               Bano N. et al. Dominance of Mycoplasma in the guts of the long-jawed mudsucker, Gillichthys mirabilis, from five California salt marshes // Environ. Microbiol. – 2007. – V. 9. – P. 2636-2641.

5.                                              Бельк       Н.Л.   и   др.   Молекулярно-генетическая   детекция непатогенного     генотипа    Spironucleus     barkhanus     (Diplomonadida: Hexamitidae) в черном байкальском хариусе (Thymallus arcticus baicalensis Dybowski, 1874) // Известия РАН. Серия биологическая. – 2008. – Т. 35, № 2. – С. 253-256.

6.                                              Дзюба   Е.В.   и   др.   Генетическое   разнообразие   кишечной микрофлоры черного байкальского хариуса (Thymallus arcticus baicalensis Dybowski, 1874) // Материалы VI Международной научной конференции: «Современное  состояние  и  перспективы развития  микробиологии  и биотехнологии». — Минск, 2008. — С. 85-87.