BioScience Blog – Научный Биологический блог

Нитрилы карбоновых кислот — органические соединения, содержащие одну или несколько цианогрупп – C≡N, связанных с органическим радикалом.

Нитрилазы, ферменты, осуществляющие гидролиз нитрилов до соответствующих карбоновых кислот, впервые были обнаружены у растений. Например, нитрилаза растения Arabidopsis thaliana катализирует гидролиз индол-3-ацетонитрила до до-уксусной кислоты и аммония. Впоследствии было обнаружено, что нитрилазы широко распространены у различных групп микроорганизмов: Alcaligenes, Agrobacterium, Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Nocardia, Pseudomonas, Rhodococcus и др. [1-4].

Цель работы: клонирование полной последовательности гена нитрилазы из Pseudomonas fluorescens С2 и ее последующее секвенирование.

Культуру Pseudomonas fluorescens выращивали на минеральной безазотной солевой среде N. В качестве источника углерода и азота были использованы ацетонитрил или изобутиронитрил в концентрации 10 мМ. Препараты хромосомной ДНК получали фенольным методом, модифицированным для выделения ДНК из актиномицетов.

Амплификацию гена нитрилазы проводили на термоциклере Т3 (Biometra, Германия) с использованием Taq-SE-полимеразы производства ООО «СибЭнзим» (Новосибирск) и праймеров, комплементарных концевым последовательностям гена nitA Acidovoraxfacilis 72 W (AX384691):

Acidv-1 5/-ATGGTTTCGTATAACAGCAAGTTCCTC и Acidv-25/-CTACTTTGCTGGGACCGGTTCTTC.

Режим амплификации: 94ºс – 20 с; 68ºС – 30 с; 72ºС – 100 с (35 циклов).

Электрофоретическое разделение продуктов реакции проводили в 1,2 %агарозном геле в трис-боратном буфере при напряженности электрического поля 6 В/см [5]. Для оценки молекулярной массы фрагментов ДНК использовали маркер 1 kb (ООО «СибЭнзим»).

Для клонирования использовали вектор pUC19. Для получения рекомбинантного вектора со вставкой в одну микропробирку вносили вектор и 5-кратный избыток переосажденного ПЦР-фрагмента, соответствующего гену нитрилазы, в среде, содержащей буфер для T4 ДНК-лигазы, 1 мМ АТФ, 10 Ед T4 ДНК-лигазы и 5 Ед рестриктазы SmaI, инкубировали при 37° 1 час.

Полученной рекомбинантной конструкцией трансформировали клетки E. coli DH5α методом электропорации в 1 мм кюветах при напряжении 2500 В, 10 мС.

Плазмидную ДНК из полученных клонов выделяли методом щелочного лизиса. Для обнаружения клонов, содержащих рекомбинантную плазмиду с геном нитрилазы, проводили ПЦР с праймерами Acidv 1/2 (рис. 1).

Рис. 1. Элекрофоретическое разделение фрагментов, соответствующих гену нитрилазы, амплифицированных из препаратов ДНК клонов E.
coli.

С плазмидной ДНК ген нитрилазы амиплифицировали с фланкирующими последовательностями вектора с применением универсального и обратного праймеров M13 (рис. 2).

В результате секвенирования установлено, что последовательность гена нитрилазы Pseudomonas fluorescens на 99,7% гомологична гену Acidovoraxfacilis 72W.

Работа поддержана ВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы –2010школы(2 годы)» и грантом РФФИ 07-04-96071-урал_а.

Литература

1.                                        BanerjeeA.
et al. The nitrile-degrading enzymes: current status and future prospects // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2002. – V. 60. – P. 33-44.

2.                                         Cowan D. et al.
Biochemistry and biotechnology of mesophilic and thermophilic nitrile metabolizing enzymes // Extremophiles. – 1998. – V. 2, № 3. – P. 207-216.

3.                                        Клонирование ДНК. Методы / Пер. с англ.; под ред. Д. Гловера. – М.: Мир, 1988.-538 с.

4.                                        Asano Y. Overview of screening for new microbial catalysts and their uses in organic synthesis – selection and optimization of biocatalysts // J. Biotechnol. – 2002. – V. 94. – P. 65-72.

5.                                        Маниатис и др. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. — М.: Мир, 1984.-333 с.