Васильева С.В., Стрельцова Д.А. О ДВУХ АЛЬТЕРНАТИВНЫХ МЕХАНИЗМАХ РЕПАРАЦИИ ДНК ESCHERICHIA COLI, СПОСОБНЫХ ВНЕСТИ ВКЛАД В ГЕНЕТИЧЕСКУЮ НЕСТАБИЛЬНОСТЬ КЛЕТКИ ПРИ АНАЭРОБНОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ
Стабильность генома — фундаментальная проблема генетики. Одним из факторов, приводящих к генетической нестабильности, является гипоксия — культивирование клеток с ограничением доступа кислорода. В условиях гипоксии генное проявление играет важную роль в росте и развитии солидных опухолей и еответ на терапию. В системе клеток млекопитающих индуцированная гипоксией генетическая нестабильность, как правило, связана с нарушением функционирования систем репараций клетки (mismatch repair [MMR] – индукция ингибитора HIF1 alpha; гомологическая рекомбинация – репрессия гена RAD51 и т.д. [1,2]). Лежащий в основе молекулярный механизм, контролирующий эти процессы, неизвестен. В настоящее время в связи с вышеизложенным получает все большее развитие изучение механизмов генетической нестабильности в условиях гипоксии и разработка специальных методов, направленных на ее преодоление.
Цель настоящей работы — изучение роли универсальной сигнальной молекулы оксида азота (NO) в генетической изменчивости факультативного анаэроба Escherichia coli.
Основанием для этого послужила работа о способности Е.соН продуцировать NO в анаэробных условиях [3].
Известно, что в клетках E. coli процессы метаболизма в условиях гипоксии обеспечиваются функционированием основного белка анаэробиоза – FNR [4Fe-4S]2+ – контролирующего экспрессию 297 генов [4]. С другой стороны, в норме в E. coli в условиях гипоксии синтезируется NO – сигнальная молекула, взаимодействие которой с полимерным [Fe-S] кластером приводит к инактивации белка FNR и последующему ингибированию метаболических и ДНК-репарационных FNR-зависимых механизмов.
Работа проводилась по двум направлениям – влияние гипоксии на:
1) показатели экспрессииого sfiA, одн из генов «error-prone» SOS-репарационного ответа, приводящего к мутационным изменениям в штамме E. coli PQ37 со слитым опероном [sfiA::lacZ] — с количественной оценкой индукции этой системы на основе колориметрического теста на фермент β-галактозидазу;
2) уровень экспрессии гена aidB1, включенного в генетический контроль безошибочного «error-proof» Ada-пути репарации алкилированных повреждений ДНК. Уникальность этого гена — в его йномдво генетическом контроле: в аэробных условиях экспрессия регулируется метилированным белком meAda, а в анаэробных – фактором σs (белок RpoS). В исследованиях этого направления экспрессия гена aidB 1 изучена на штамме E. coli MV2176 [aidB1::lacZ]. В качестве источника NO использованы нитрозильные комплексы железа.
При культивации клеток E. coli MV2176 в условиях гипоксии (в отсутствие обработки) зарегистрировано 2-3-кратное увеличение уровня экспрессии гена aidB1, в сравнении с аэробным контролем, что является отражением его генетического статуса. Установлено, что уровень экспрессии aidB1
в присутствии NO снижался в 2 раза относительно максимального контроля, свидетельствуя о негативной регуляции (down-regulation) NO процесса его экспрессии (рис. 1). Таким образом, в анаэробных условиях снижается эффективность безошибочного Ada-репарационного процесса и, соответственно, растет вероятность возникновения мутаций.
Фундаментальная азвитияпроблема р SOS-репарационного ответа в E. coli в условиях гипоксии изучена нами впервые. В отсутствие О2 «спонтанная» экспрессия sfiA относительно титра культивируемой популяции количественно соответствовала показателю аэробного SOS-процесса. Однако, в условиях аэрации уровень «спонтанной» экспрессии sfiA оставался постоянным (отн. ур. экспр. = 15), в то же время в условиях гипоксии показатель возрастал (от 10 до 15). Введение в среду инкубации донора оксида азота приводило к 2-кратному росту экспрессии гена sfiA в условиях гипоксии (до 4 часов инкубации) (рис. 2).
Кинетическая зависимость экспрессии гена sfiA в аэробных условиях была более сложной: отмечено 6-кратное возрастание уровня экспрессии в течение 1-ых двух часов (рис. 3) и последующее снижение уровня к четвертому часу инкубации. Таким образом, значимый уровень экспрессии гена sfiA (SOS-репарационного ответа) в интактных клетках E. coli регистрируется ипр культивировании как в аэробных условиях, так и без O2.
Таким образом, в двух экспериментальных системах нами впервые получены экспериментальные подтверждения гипотезы о том, что оксид азота, генерируемый клетками E. coli в условиях гипоксии, приводит к усилению развития ошибочного SOS-репарационного процесса, являющегося одним из главных факторов генетической нестабильности бактериальной клетки, с одновременным ослаблением функций генов безошибочной системы Ada-ответа.
Литература
1. Bindra R.S. et al. Decreased Expression of the DNA Mismatch Repair Gene Mlh1 under Hypoxic Stress in Mammalian Cells // Mol. Cell. Biology. – 2003. – V. 23, № 9. – P. 3265-3273.
2. Rodriguez-Jimenez F.J. et al. Hypoxia causes downregulation of mismatch repair system and genomic instability in stem cells // Stem Cells. — 2008. – V. 26, № 8. – P. 2052-2062.
3. Poole R.K. et al. Nitric oxide, nitrite, and Fnr regulation of hmp (flavohemoglobin) gene expression in Escherichia coli K-12 // J. Bacteriol. – 1996.-P. 5487-5492.
4. Crack J.C. et al. Superoxide-mediated amplification of the oxygen-induced switch from [4Fe-4S] to [2Fe-2S] clusters in the transcriptional regulator FNR // PNAS. – 2007. – V. 104, № 7. – P. 2092-2097.
Загрузка ...