BioScience Blog – Научный Биологический блог

Одной из актуальных проблем физиологии растений является выяснение механизмов трансдукции гормональных сигналов. В литературе приводятся данные об образовании активных форм кислорода (АФК) под действием ауксина на растения. Сообщалось о том, что АФК способны имитировать эффекты ауксина на ризогенез, деление и растяжение клеток. Однако неясно, участвуют ли они в трансдукции ауксинового сигнала или задействованы на более поздних этапах. В нашей работе образование АФК детектировалась с помощью флуоресцентной микроскопии, с применением флуоресцентной метки 2,7′-дихлорфлуоресцина диацетата. Показано, что ауксин через 15-30 мин после внесения вызывал образование АФК в 3-4-дневных проростках арабидопсиса. Мы изучали также влияние этих свободных радикалов на экспрессию inplantaауксин-зависимой генетической конструкции Dr5::GUS, которая была создана на основе промотора гена первичного ответа на ауксин. Опыты проводили на 3-4-дневных проростках трансгенного арабидопсиса, при относительно короткой (4 часа) экспозиции. Индукторы и ингибиторы вносили в раствор, в котором инкубировали проростки. Влияние на экспрессию данной генетической конструкции определяли количественно по активности GUS invitroфлуорометрическим методом. Нами изучено влияние различных АФК: супероксида, гидроксил-радикала, пероксида водорода и пероксинитрита, – на экспрессию Dr5::GUS. Для получения супероксид-радикала использовали систему, состоящую из НАДН, феназинметасульфата и тетразолиевого нитросинего. В качестве альтернативы был использован метилвиологен, который способен восстанавливаться гем-содержащими ферментами. Гидроксил радикал получали с помощью реактива Фентона, а пероксинитрит – с помощью реакции нитрита и пероксида водорода в кислой среде. Пероксид водорода вносили в раствор инкубации до конечной концентрации от 100 мкМ до 10 мМ, в качестве альтернативы использовали систему, генерирующую пероксид водорода из глюкозы с использованием глюкозооксидазы. Образование пероксида водорода в системе лимитировалось количеством фермента, которое было подобрано из расчета, чтобы система генерировала пероксид водорода от 1 мкМ/мин до 100 мкМ/мин. Показано, что только супероксид-радикал достоверно индуцировал транскрипцию этой генетической конструкции (на 100-147%). Ни пероксинитрит, ни гидроксил-радикал не индуцировали Dr5::GUSи, наоборот, подавляли эффект ауксина на 48-58% и 34-62%, соответственно. Пероксид водорода сам по себе не оказал заметного эффекта. В то же время система с глюкозооксидазой в варианте, генерирующим 1 мкМ/мин пероксида водорода, вызывала ингибирование активности GUSкак при индукции ауксином, так и в контроле. Дополнительно был поставлен ряд опытов со скевенджерами свободных радикалов и ингибитором НАД(Ф)Н-оксидазы. Было показано, что скевенджер супероксида СиСЬ подавлял эффект ауксина на экспрессию Dr5::GUSна 35^40%, а скевенджеры пероксида водорода KJ и пероксинитрита тиомочевины усиливали эффект ауксина на 72% и 62%, соответственно. Ингибитор НАД(Ф)Н-оксидазы ZnCb подавлял эффект ауксина на 24-54%. Таким образом, радикал супероксида способен активировать ауксин-чувствительный промотор, однако остается неясным, участвует ли эта АФК в трансдукции ауксинового сигнала.