BioScience Blog – Научный Биологический блог

Тишковская А.В.

Основные метаболитические пути в клетках основаны на окислительно-восстановительных реакциях, побочным продуктом которых часто являются активные формы кислорода (ROS), токсичные для клеток. Их накопление приводит к патогенезу и прогрессии опухолей, диабета, нейродегенеративных заболеваний. В норме ROS уничтожаются внутриклеточными антиоксидантами. При терапии заболеваний часто используются экзогенные антиоксиданты. Одним из таких препаратов является а-липоевая кислота. Известно, что некоторые антиоксиданты, не влияя на состояние нормальных клеток, вызывают апоптотическую гибель трансформированных клеток. Однако влияние а-липоевой кислоты на пролиферативную активность клеток практически не изучено. Наши исследования проводились на клетках культуры эпидермоидной карциномы человека А431. Для исследования влияния а-липоевой кислоты на клетки А431 были использованы следующие методы: МТТ-тест, метод проточной цитофлуориметрии, иммуноцитохимические окрашивания. Подсчитывались митотический и апоптотический индексы, было проанализировано содержание в популяции полиморфноядерных клеток. Исследование выживаемости клеток А431 с помощью МТТ-теста при воздействии а-липоевой кислоты в течение 72 часов показало, что гибель клеток начинается при введении 200 мкМ. Данные проточной цитофлуорометрии показывают, что в контроле 53,04±2,86 % клеток находятся в G1 периоде; 19,02±0,62% – в S-периоде; 17,38±3,56% – в G2 периоде. Апоптотические клетки составляют 3,52+0,2%, полиплоидные клетки – 1,44+0,88 % в популяции. При воздействии 200 мкМ происходит изменение распределения клеток по стадиям клеточного цикла и накопление клеток на одной из стадий (51,95±2,1%). Однако график распределения не позволяет точно идентифицировать, на какой именно стадии происходит остановка клеточного цикла. Морфологические исследования показывают, что размер ядер при воздействии 200 мкМ увеличен по сравнению с контролем. Подсчет митотического индекса не выявляет значительного увеличения митотической активности. Анализ включения BrdU показывает уменьшение включения метки в ядро. Окрашивание клеток антителами к белку р53 не выявляет накопления этого белка в ядрах. На основании вышеизложенного мы предполагаем, что воздействие 200 мкМ а-липоевой кислоты вызывает блок клеточного цикла в G2 периоде. При воздействии 300 мкМ блок сохраняется. Доля апоптотических клеток увеличивается, что также подтверждается подсчетом апоптотического индекса. Блок клеточного цикла является обратимым. Клетки культуры А431 характеризуются высоким содержанием в популяции полиморфноядерных клеток (микроядра, гигантские ядра и ядра неправильной формы). Высокое содержание таких клеток отражает генетическую нестабильность клеток А431. Воздействие а-липоевой кислоты в концентрациях от 5 до 200 цМ приводит к достоверному снижению в популяции доли клеток с микроядрами. Окраска клеток антителами к р53 демонстрирует накопление р53 в полиморфных ядрах, что может свидетельствовать о последующей активации апоптоза в этих клетках. В целом, можно высказать предположение о том, что воздействие а-липоевой кислоты приводит к элиминации клеток А431 с генетической нестабильностью. Клетки, не имеющие значительных генетических дефектов, блокируются на стадии G2 клеточного цикла, полиморфноядерные клетки продолжают движение по циклу и могут элиминироваться либо в G1 периоде клеточного цикла, либо в результате митотической катастрофы.