BioScience Blog – Научный Биологический блог

Плахотин А.Н., Петрова Р.Р., Межевикина Л.М.

Институт биофизики клетки РАН, Пущино (Россия). E-mail: rushanap@mail.ru

Для работы с эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК) используют коммерческие рекомбинантные белки LIF (Leukemia Inhibitory Factor), полученные в разных системах экспрессии и обладающие разной биологической активностью. Ранее было показано, что рекомбинантный LIF человека обладает более высокой биологической активностью, чем аналогичный ему LIF мыши.

Попытки получения рекомбинантного белка LIF в E. coliпредпринимались неоднократно, но до сих пор не увенчались успехом, т.к. в прокариотических векторных системах LIF вырабатывается в нерастворимой форме в тельцах включения. После выделения из телец включения и последующей химической очистки снижается конечный выход продукта, падает биологическая активность.

В нашей работе после клонирования гена lifв векторную систему pET28b и трансформации клеток E.coliRosetta был экспрессирован рекомбинантный белок LIF человека. Но при детальном исследовании данных секвенирования pET28b-lif-human было обнаружено, что произошла единичная замена нуклеотида тимина в 466 положении триплета TGC, кодирующего аминокислоту цистеин (156 аминокислота), на цитозин, с последующим формированием аргинина (CGC). Известно, что именно цистеин принимает участие в формировании прочных дисульфидных связей зрелой молекулы белка, а в молекуле LIF за них отвечают шесть цистеинов молекулы. Замена хотя бы одной молекулы цистеина приведет к снижению прочности молекулы и, возможно, последующему повышению растворимости рекомбинантного белка LIF.

В результате проведенных исследований было показано, что рекомбинантный белок LIF человека из pET28b способен экспрессироваться как в цитоплазму клеток E. сoli(растворимая фракция), так и накапливаться в тельцах включения, хотя в предыдущих исследованиях получить растворимую фракцию рекомбинантного LIF не удавалось. Поэтому последующую очистку белка проводили из растворимой фракции, так как известно, что именно растворимая форма наиболее соответствует конформации нативного белка LIF. После его очистки на Ni2+ и Со2+-хилатной агарозе (Pierce) было показано наличие рекомбинантного белка с молекулярной массой около 25 кДа, что было подтверждено Western-блотом с использованием моноклональных АТ к LIF.

Считаем, что в дальнейшей работе целесообразно провести точечные замены цистеина гена lifчеловека на аминокислоты, имеющие идентичный заряд молекулы, что позволит повысить растворимость рекомбинантного белка LIF человека и выделить его для дальнейших исследований на культурах ЭСК invitro.