BioScience Blog – Научный Биологический блог

Способность переживать неблагоприятные для роста условия является важным адаптивным свойством микробных популяций. У неспорообразующих бактерий эта способность связана с образованием покоящихся форм. Клетки спонтанно или ндуцированноилии выходят из пролиферативного цикла и длительно сохраняют жизнеспособность без роста и деления. Их часто называют жизнеспособные, но некультивируемые формы, так как они не выявляются в виде колоний при посеве на твердые питательные среды. Поскольку эти клетки обладают способностью к реверсии в вегетативные формы, они служат резервом популяции при неблагоприятных условиях. Это особенно актуально для фитопатогенных бактерий, природные популяции которых подвержены сезонным циклам.

Сотрудниками нашей лаборатории показано, что клетки фитопатогенной бактерии Erwinia carotovora при длительном инкубировании в условиях голодания способны к обратимому переходу в покоящееся состояние. При этом происходит постепенное снижение показателя титра колониеобразующих единиц (КОЕ) до невыявляемых значений. Однако после специальной процедуры «оживления» клетки восстанавливают колониеобразующую способность. Снижение КОЕ существенно ускоряется внесением в среду инкубирования синтетического аналога аутоиндуктора анабиоза С12-алкилоксибензола (С 12 – АОБ).

Нами обнаружено, что процесс перехода в состояние покоя сопряжен с трудностями выявления целевой ДНК голодающих клеток. Ранее сообщалось, что в бактериальных клеточных суспензиях накапливаются низкомолекулярные индукторы, проявляющие шаперонную активность в отношении некоторых белков и способные в значительной степени модифицировать структуру нуклеопротеинового комплекса бактерий [1]. Также известно, что у голодающих клеток бактерий происходит изменение спектра ДНК-связывающих гистоноподобных белков, которые делают определенные участки ДНК недоступными для полимераз [2]. В связи с этим мы предприняли попытку оценить матричные свойства ДНК E. carotovora. Нами роводиласьп последовательная очистка лизатов клеток; после каждой стадии очистки определялся титр геномных копий (ГК) при помощи ПЦР в реальном времени (ПЦР РВ). При количественном анализе ДНК-мишеней была использована разработанная нами тестовая система для детекции ДНК E. carotovora cо специфичными праймерами, гомологичными вариабельной области межгенного спейсера 16S-23S рРНК.

Культуры клеток, инкубированные в безуглеродной среде в течение двух месяцев, характеризовались низким значением титра ГК, определяемым в ПЦР РВ при артныхстанд способах пробоподготовки (лизис клеток кипячением в 1% Triton Х-100). При этом титр КОЕ превышал титр ГК. Стократное разведение клеточных лизатов в деионизированной воде приводило к увеличению относительного количества детектируемой ДНК. В тоже время разведение лизатов вегетативных клеток E. carotovora не приводило к увеличению титра ГК. В связи с этим, мы предположили, что в голодающих клетках присутствуют термостабильные ингибиторы ферментов нуклеинового обмена, проявляющиеся в снижении эффективности ПЦР. Действие этих ингибиторов на полимеразу снижается при понижении их концентрации. В результате диализа образцов число детектируемых ДНК-мишеней в незначительной степени возрастало. В свою очередь, последующая обработка лизатов голодающих клеток протеиназой К, увеличила количество детектируемых ДНК шенейми на порядок и более. Однако и в этом случае полного восстановления матричных свойств ДНК достичь не удавалось. Дальнейшее восстановление способности к амплификации происходило после удаления соединений, экстрагируемых органическими растворителями (фенолом и хлороформом).

При инкубировании E. carotovora
в присутствии 0,4 мМ С12-АОБ ДНК микробных клеток при помощи ПЦР не детектировалась. В тоже время данный аутоиндуктор сам по себе не влиял на эффективность ПЦР даже в концентрации 2,5 мМ. В ходе последовательной очистки клеточных лизатов культур, инкубированных в присутствии С12-АОБ, ПЦР-сигнал восстанавливался и соответствовал 100 000 ГК в 1 мл.

В исходных лизатах вегетативных клеток E. carotovora титр ГК хорошо выявлялся; проведение процедур очистки не приводило к увеличению количества детектируемых ДНК-мишеней. Таким образом, в голодающих клетках происходит существенное изменение матричных свойств ДНК, что может быть связано с изменением спектра ДНК-связывающих белков и накоплением других соединений, модифицирующих структуру ДНК. Это, по-видимому, приводит к изменению профиля экспрессии генов и способствует включению физиологической программы, необходимой для переживания условий, неблагоприятных для роста.

Литература

1.               Мулюкин А.Л. и др. Влияние микробных аутоиндукторов анабиоза – алкилоксибензолов – на структурную организацию ДНК Pseudomonas aurantiaca и индукцию фенотипической диссоциации // Микробиология. — 2005. – Т. 74, № 2. – С. 157-165

2.                Oliver J., Warner J. Randomly amplified polymorphic DNA analysis of starved and viable but nonculturable Vibrio vulnificus сells // Appl. Environ. Microbiol. – 1998. – V. 64, № 8. – P. 3025-302.