BioScience Blog – Научный Биологический блог

Введение.
Рост и образование сосудов в постнатальном периоде развития организма осуществляется через ангиогенез, артериогенез и васкулогенез. Сосудистый эндотелиальный фактор роста А (VEGF-A, далее VEGF) является одним из ключевых регуляторов этих процессов. Кроме того, показано, что VEGF обладает целым рядом дополнительных свойств, в том числе он является нейропротектором [1]. VEGF — гомодимерный гликопротеин, у которого на данный момент показано наличие двух классов изоформ, образующихся в результате альтернативного сплайсинга мРНК одного гена: стимулирующей (VEGF-Axxx) и ингибирующей (VEGF-Axxxb), где xxx — количество аминокислотных остатков в полипептидной цепи после отщепления сигнальной последовательности [2,3]. Три основных изоформы VEGF (VEGF121, VEGF165 и VEGF189) отличаются характером внеклеточной локализации и биологической активностью [4]. В связи с повышенным интересом в использовании VEGF в различных генно-клеточных терапевтических приложениях, нами проводится работа по изучению биологической активности различных изоформ VEGF в комбинациях с основным фактором роста фибробластов (bFGF, FGF-2).

Целью настоящей работы явилась оценка биологического эффекта ко-экспрессии различных комбинаций изоформ VEGF и FGF-2 генетически модифицированными клетками НЕК293Т на модели пролиферации клеток HUVEC (Human umbilical vein endothelial cells) in vitro.

Методы.
Клетки НЕК293Т культивировались на среде DMEM с добавлением 10% FBS и 1х раствора пенициллин-стрептомицин. Трансфекция двухкассетными плазмидами (pBud-VEGF121-FGF2, pBud-VEGF165-FGF2, pBud-VEGF189-FGF2, pBud-EGFP) проводилась с использованием реагента TurboFect (Fermentas) в соответствии с рекомендациями производителя. Среда менялась на свежую через 12 часов

после трансфекции. Через 48 часов после трансфекции среда собиралась, центрифугировалась при 2000g в течение 5 минут, а полученный супернатант помещался на клетки HUVEC в комбинации со средой без факторов роста. Пролиферативный потенциал оценивался с помощью количественного MTT теста.

Результаты.
В ходе настоящей работы на основании данных спектрофотометрических измерений в ходе МТТ-теста показано увеличение пролиферативной активности клеток HUVEC, обработанных культуральной средой клеток HEK293T, трансфецированных двухкассетными плазмидами, экспрессирующими различные комбинации изоформ VEGF и FGF-2 (рис. 1). Экспрессия указанных целевых генов в клетках HEK293T подтверждена с помощью иммуноблоттинга и иммуноцитохимии.

Рис. 1. Результаты измерения оптической плотности в ходе МТТ-теста. Измерения проводились при добавлении культуральной среды клеток HEK293T в количестве 30%, 3% и 0,3% (обозначения на рисунке 0.3x, 0.03x и 0.003x соответственно) от общего объема среды, на которой выращивались клетки HUVEC. В качестве отрицательного контроля использовали культуральную среду нетрансфецированных клеток (NTC).

Литература

1.                                        Janigro D. The cell cycle in the central nervous system. – Humana Press, 2006. – 584 p.

2.                                        Bates D.O. et al. VEGF 165b, an inhibitory splice variant of vascular endothelial growth factor, is down-regulated in renal cell carcinoma // Cancer Res. – 2002. – V. 62, № 14. – P. 4123-4131.

3.                                         Tischer E. et al. The human gene for vascular endothelial growth factor. Multiple protein forms are encoded through alternative exon splicing // J. Biol. Chem. – 1991. – V. 266, № 18. – P. 11947-11954.

4. Cressey R. et al. Alteration of protein expression pattern of vascular endothelial growth factor (VEGF) from soluble to cell-associated isoform during tumourigenesis // BMC Cancer. – 2005. – V. 5, № 128. – 8 p.